Hematoonkologia.pl: Pańska praca została doceniona przez wybitnych badaczy. Może Pan nieco przybliżyć zagadnienia, które zostały w niej zawarte?
Filip Garbicz: Koncept inhibicji rodziny kinaz PIM w nowotworach hematologicznych, a zwłaszcza w szpiczaku plazmocytowym, jest podejmowany w literaturze naukowej od lat. Onkogenne kinazy PIM – z uwagi na regulację fundamentalnych procesów warunkujących wzrost i przeżycie komórek nowotworowych oraz silne współdziałanie z innymi onkogenami – stanowią bardzo interesujący cel terapeutyczny. Charakteryzuje je wysoka aktywność w komórkach układu krwiotwórczego, nie są natomiast niezbędne do funkcjonowania innych układów, przez co małocząsteczkowe inhibitory kinaz PIM mogą okazać się bardziej selektywne i mniej toksyczne od klasycznej chemioterapii bądź innych inhibitorów kinaz dostępnych na rynku.
Firmy farmaceutyczne i ośrodki akademickie z całego świata od dawna podejmują próby zaprojektowania skutecznego kompetycyjnego inhibitora kinaz PIM, jednak większość z nich jest zbyt mało selektywna, a przez to toksyczna. Wiele z nich nie wykazywało również pożądanej aktywności w badaniach klinicznych 1 fazy, czego przyczyny wciąż pozostają zagadką i są przedmiotem naszych intensywnych badań.
W moim projekcie ożywiam temat inhibicji kinaz PIM w hematoonkologii. Podczas doktoratu rozpocząłem współpracę z polską firmą biotechnologiczną Ryvu Therapeutics S.A. oraz włoskim koncernem Menarini, które rozwijają wspólnie projekt inhibitora pan-PIM MEN1703 (wcześniej znanego pod nazwą SEL24). Jest to związek skutecznie hamujący kinazy PIM, które są niezwykle istotne w biologii szpiczaka. Porównałem skuteczność MEN1703 oraz innych inhibitorów PIM w panelu linii szpiczakowych oraz komórkach od pacjentów i był to jedyny związek zdolny do indukcji śmierci nowotworowych plazmocytów.
Ten inhibitor był badany także w chłoniakach w powiązaniu z innym szlakiem molekularnym?
Zgadza się, w zeszłym roku na łamach czasopisma Cancer Research opublikowaliśmy wyniki naszego projektu, w którym badaliśmy działanie MEN1703 w chłoniakach B-komórkowych. Pokazaliśmy, że zahamowanie kinaz PIM blokuje funkcjonowanie czynnika transkrypcyjnego MYC, który często ulega translokacji i nadekpresji w tej grupie nowotworów. Ponadto, inhibitor MEN1703 przełamywał oporność komórek chłoniakowych na terapię przeciwciałami anty-CD20, co było związane z obniżeniem aktywności MYC i zwiększoną ekspresją CD20 na powierzchni tych komórek.
Inhibitor kinaz PIM, nad którym pracujemy, jest pierwszym tak zaawansowanym projektem powstałym w Polsce. Jest on badany klinicznie od 2017 r. w badaniu 1/2 fazy DIAMOND-01 (NCT03008187), w ramach którego podawany jest pacjentom z ostrą białaczką szpikową. Dotychczasowe wyniki tego badania wskazują na jego bezpieczeństwo i stosunkowo niską toksyczność, u części pacjentów zaobserwowano również pierwsze remisje. Wyniki tego badania mogą okazać się przełomem w obszarze celowanej inhibicji kinaz PIM. Podobne badanie konkurencyjnego inhibitora PIM zostało przedwcześnie zakończone z powodu braku aktywności w AML (NCT02078609). Czekamy zatem z niecierpliwością na wyniki kolejnych faz badań klinicznych MEN1703, niewykluczone jest również rozszerzenie zakresu tych badań na podstawie wyników naszych badań przedklinicznych.
Czy ma znaczenie, że ten związek indukuje śmierć komórki, a także działa w interakcji z komórkami śródbłonka?
Wyniki badań zaprezentowane podczas konferencji pochodzą z badań przedklinicznych z użyciem modeli in vitro oraz ex vivo. Odtworzyliśmy w laboratorium procesy zachodzące w szpiku pacjentów chorych na szpiczaka plazmocytowego. Przy użyciu komórek wyizolowanych z pobranego szpiku, nowotworowych i zrębowych (hodowanych razem), stwierdziliśmy szybszą proliferację i lepsze przeżycie komórek nowotworowych w obecności zrębu szpiku, w szczególności gdy były to komórki śródbłonka naczyniowego. Komórki nowotworu, który rośnie w organizmie człowieka czy zwierzęcia zazwyczaj bardzo trudno jest utrzymać w hodowli in vitro, ponieważ brakuje im specyficznych sygnałów z mikrośrodowiska. W szpiczaku plazmocytowym rezydującym niemal wyłącznie w szpiku (poza rzadkimi przypadkami guzów pozaszpikowych lub białaczki plazmatycznokomórkowej), sygnały z niszy szpikowej odgrywają szczególnie dużą rolę, pozwalają przetrwać komórkom nowotworowym i biorą udział w nabywaniu oporności na terapię. Badając ekspresję kinaz PIM w szpiku pacjentów ze szpiczakiem za pomocą immunohistochemii, zauważyliśmy wysoką ekspresję kinaz PIM nie tylko w plazmocytach nowotworowych, ale też w komórkach śródbłonka towarzyszących temu nowotworowi. Wyniki wielu wcześniejszych badań wykazały, że przerwanie interakcji komórek szpiczaka z komórkami śródbłonka szpiku może pozbawić go istotnych sygnałów promujących przeżycie. Zahamowanie szpikowej angiogenezy może być zatem procesem, któremu należy się przyjrzeć bliżej w kontekście opracowywania terapii szpiczaka plazmocytowego.
Relacja nowotwór-mikrośrodowisko zaprząta głowę wielu badaczy.
Niektóre nowotwory tworzą przerzuty głównie do wątroby, inne do kości, jeszcze inne preferują mózg. Sygnały pochodzące z tych organów ewidentnie promują przeżycie w nich komórek określonego podtypu nowotworu. Aby nowotwór był w stanie stworzyć nowe ognisko w innym narządzie, musi mieć do tego zapewnione sprzyjające mikrośrodowisko. Musi on nie tylko uciec przed atakiem układu immunologicznego, ale też pozyskać odpowiedni koktajl cytokin wydzielanych przez komórki zrębu danego narządu, który zapewni mu przetrwanie. Dzięki nowym technikom biologii molekularnej dopiero zaczynamy poznawać mechanizmy stojące za tymi interakcjami. Coraz częściej stosowane sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (scRNAseq) pozwala z niesłychaną precyzją określić profil ekspresji wszystkich genów w tysiącach komórek pobranych z danego ogniska. Dzięki temu jesteśmy w stanie odkryć, jaki jest dokładny skład mikrośrodowiska nowotworu oraz jakie patologiczne procesy biologiczne wpływają na jego funkcjonowanie. Pozwala to również na znalezienie nowych leków, które mogłyby wpływać na tak znalezione mechanizmy.
Jaka droga naukowa przywiodła Pana do dnia nagrody na międzynarodowej konferencji?
Na 3 roku studiów interesowałem się medycyną i jej podstawami molekularnymi, zostałem więc członkiem Studenckiego Koła Histologii i Embriologii przy Warszawskim Uniwersytecie Medycznym. Moim opiekunem naukowym był prof. Paweł Włodarski. Oceniam ten etap jako bardzo rozwojowy. W laboratorium poznawałem metody badań podstawowych i eksperymentalnych w dziedzinie onkologii. Razem z moim przyjacielem, lek. Dawidem Mehlichem, badaliśmy ekspresję onkogennych i supresorowych microRNA w próbkach pobranych z tkanki nowotworowej pacjentów, szukaliśmy markerów prognostycznych, które korelowałyby z przebiegiem danej choroby. Dużą rolę odegrała współpraca z naszym starszym kolegą, dr Emirem Sajjadem, który jako neurochirurg operował wielu pacjentów z nowotworami ośrodkowego układu nerwowego. Mierzył się on z wieloma niewiadomymi dotyczącymi adekwatnego postępowania i ryzyka nawrotu u swoich pacjentów, na które próbowaliśmy znaleźć wspólnie odpowiedź badając zebrane przez niego tkanki. Praca ta wzbudzała we mnie często fascynację, ale i frustrację, wiele razy żmudne przygotowywanie wielomiesięcznych eksperymentów kończyło się wynikiem negatywnym. Cały czas napędzała mnie jednak ciekawość – ile informacji można uzyskać z fragmentu guza utrwalonego i zatopionego w parafinie? Jakie właściwości tych nowotworów odpowiadają za ich łagodny lub agresywny przebieg? Czy możemy przewidzieć, który pacjent odpowie na dany rodzaj terapii? Są to dość fundamentalne pytania w onkologii, na które wciąż nie znamy jednoznacznej odpowiedzi.
W Zakładzie Histologii miałem również przyjemność współpracować z lek. Łukaszem Hutnikiem, specjalizującym się w hematologii i onkologii dziecięcej. Wprowadził mnie w tematykę badania nowotworów hematologicznych. Razem realizowaliśmy projekt badawczy dotyczący zespołów mieloproliferacyjnych (MPN) u dzieci. MPN jest chorobą rzadką, zwłaszcza w populacji pediatrycznej, jednak na warszawskim oddziale hematologii mieliśmy całkiem sporą grupę pacjentów z podejrzeniem lub potwierdzoną diagnozą tej choroby. W tym czasie patogeneza MPN zaczęła być dopiero odkrywana: u pacjentów z MPN opisano nabyte zmiany genetyczne takie jak mutacja kinazy JAK2, kalretikuliny (CALR) czy receptora dla trombopoetyny (MPL). Często postawienie rozpoznania u takiego pacjenta nie było łatwe, dopiero na podstawie długotrwałej diagnostyki, badania histopatologicznego i charakterystyki przebiegu klinicznego ustalana była diagnoza i włączane odpowiednie leczenie. Miałem ogromną satysfakcję, mogąc pobrać szpik czy krew obwodową, tego samego dnia wyizolować DNA, wykonać badanie PCR i przesłać moim kolegom wynik potwierdzający obecność danej mutacji. Obecnie takie badania są już na szczęście wykonywane komercyjnie, a nie jedynie naukowo.
W ten sposób około 7 lat temu zaczęło się moje zainteresowanie hematologią. Ponieważ myślałem o wyborze specjalizacji z hematologii dziecięcej, wakacyjne praktyki z pediatrii odbyłem na oddziale, na którym pracował dr Hutnik. Pewnego dnia pobraliśmy szpik od dziewczynki z podejrzeniem zespołu mieloproliferacyjnego i mieliśmy możliwość wysłać jego część na darmowe sekwencjonowanie eksomowe metodą NGS w ramach współpracy naukowej. Ponieważ nasze dotychczasowe badania genetyczne komórek pobranych z krwi obwodowej tej dziewczynki wykazały brak znanych mutacji odpowiadających za rozwój MPN, chcieliśmy scharakteryzować zmiany, jakie przyczyniły się do powstania tej choroby u naszej młodej pacjentki. Dr Hutnik wysłał mnie z pobranym szpikiem do pracowni diagnostycznej, gdzie zacząłem izolację komórek i przygotowanie DNA do sekwencjonowania. Tego dnia poznałem dr Elizę Głodkowską-Mrówkę (wówczas związaną z WUM, obecnie kierującą Zakładem Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej w Instytucie Hematologii i Transfuzjologii), lekarkę i naukowczynię z ogromnym doświadczeniem międzynarodowym, znającą wielu ekspertów w dziedzinie hematologii eksperymentalnej. Szybko znaleźliśmy wspólny język. Dzięki naszej rozmowie nabrałem chęci do bardziej samodzielnych działań w hematologii. Miesiąc później znalazłem w swojej skrzynce mailowej wiadomość od lek. Joanny Barankiewicz z IHiT z kategorii „Praca szuka człowieka”. Była to propozycja dołączenia do projektu naukowego, w którym lekarze z IHiT poszukiwali markerów odpowiedzi na leczenie immunomodulujące w szpiczaku plazmocytowym. W ten sposób związałem się z IHiT i tematyką szpiczaka, którą zgłębiałem w laboratorium i na oddziale pod opieką dr Barankiewicz. Projekt ten, zakończony w zeszłym roku publikacją, okazał się sukcesem i pozwolił mi poznać świat nauki na tyle dobrze, że postanowiłem napisać własny wniosek grantowy.
Gdy dotarła do mnie wiadomość o ogłoszeniu programu Diamentowy Grant, finansowanego przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego, długo zastanawiałem się czy potrafiłbym połączyć studia i pracę jako lekarz z działalnością naukową. Los się do mnie uśmiechnął – opowiedziałem mojemu szefowi, a obecnie również promotorowi prof. Przemysławowi Juszczyńskiemu o moich wahaniach w kwestii złożenia wniosku. Profesor dał mi wiele wskazówek, propozycję tematu oraz część danych wstępnych i zaproponował rodzaj naukowej fuzji – badania prowadzone w jego laboratorium nad inhibicją kinaz PIM i moimi wcześniejszymi doświadczeniami ze szpiczakiem plazmocytowym.
Kilka długich miesięcy później dotarła do mnie wiadomość o moim pierwszym naukowym sukcesie – otrzymałem finansowanie na rozpoczęcie własnego projektu. Przez następne 3 lata poznawałem blaski i cienie eksperymentalnej pracy naukowej. Wiele hipotez (pomimo mocnego poparcia danych literaturowych i w mojej ocenie wysokiego prawdopodobieństwa potwierdzenia w modelach komórkowych) okazało się fałszywych. Musiałem się z tym zmierzyć. Co kilka miesięcy rewidowałem plan doktoratu, likwidowałem wątki nierokujące lub pozbawione większego znaczenia dla projektu i zaczynałem inne, często oparte na podstawie najnowszych publikacji rzucających nowe światło na badane przeze mnie procesy bądź prezentujących nowatorską metodykę. Moją uwagę w pewnym momencie przykuło mikrośrodowisko nowotworu, którym zajmował się w tym samym czasie mój opiekun naukowy, dr Maciej Szydłowski. Tak jak wspomniałem wcześniej, w jednym z preparatów szpiku zauważyliśmy wysoką ekspresję badanych przez nas kinaz PIM w śródbłonku nowotworowym i – co było zaskakujące – ich brak w śródbłonku zdrowego szpiku. Założyłem, że aktywacja kinaz PIM w śródbłonku nowotworowym może odgrywać istotną rolę w patogenezie szpiczaka plazmocytowego.
Chciałem dokładniej zbadać, jaką rolę w komórkach śródbłonka pełnią kinazy PIM, czy komórki śródbłonka faktycznie potrafią stymulować wzrost komórek szpiczaka oraz czy ta interakcja może być przerwana przez zastosowanie specyficznego inhibitora kinaz PIM. Aby odpowiedzieć na te pytania uzyskałem finansowanie dzięki programowi PRELUDIUM Narodowego Centrum Nauki. Ponownie zmierzyłem się ze znanym mi już problemem: hipoteza dotycząca mechanizmu działania kinaz PIM w śródbłonku, na której oparłem grant, okazała się później błędna. Tydzień za tygodniem otrzymywałem niezwykle frustrujące wyniki przeciwne do moich wcześniejszych założeń. W pewnym momencie projektu z dużą dozą pewności traktowałem jedynie 2 obserwacje: dodanie inhibitora PIM do komórek szpiczaka powoduje ich śmierć, natomiast ten sam związek dodany do komórek śródbłonka powoduje zmianę ich kształtu, co było widoczne pod zwykłym mikroskopem świetlnym, nie uruchamiając jednak procesu śmierci tych komórek. Postanowiłem więc zmienić kierunek projektu i skoncentrować się na zmianach w cytoszkielecie komórek śródbłonka, które okazały się dominującym efektem działania MEN1703 w tych komórkach. Zaobserwowałem znaczącą depolimeryzację cytoszkieletu aktynowego, odpowiadającego za migrację śródbłonka i tworzenie nowych naczyń. Cytoszkielet pozwala śródbłonkowi przybierać określony kształt, co jest niezbędne do stworzenia funkcjonalnej ściany naczyń krwionośnych. Proces ten jest mocno zaburzony przez inhibitory kinaz PIM. To był przełom – rozwijałem ten wątek dalej i odkryłem, że jest to zależne od małych GTPaz z rodziny Rho, które zarządzają polimeryzacją aktyny w komórkach śródbłonkowych.
Powyższe obserwacje sugerują, że związek, który badamy, nie tylko efektywnie indukuje śmierć komórek w modelach nowotworów hematologicznych, może być również potencjalnie lekiem hamującym angiogenezę nowotworową. W zdrowym śródbłonku kinazy PIM prawdopodobnie nie pełnią istotnej funkcji. Potwierdzają to do pewnego stopnia modele mysie z delecją wszystkich trzech kinaz PIM: są żywe, płodne, jednak znacznie mniejsze niż myszy dzikie. Wprawdzie obserwuje się u nich zaburzenia w obrębie układu krwiotwórczego, nie mają za to żadnych zaburzeń w obrębie układu sercowo-naczyniowego.
Obecnie wyczerpałem już możliwości badań z użyciem modeli in vitro i w najbliższej przyszłości rozpoczynamy testy w modelach zwierzęcych szpiczaka, które są znacznie wierniejsze chorobie obserwowanej u naszych pacjentów. Dzięki temu będziemy mogli stwierdzić, czy badany przez nas inhibitor jest dobrym kandydatem do dalszych badań jako element terapii szpiczaka plazmocytowego.
Pana dalsze plany są związane z ukończeniem prac w ramach tego grantu?
Jestem związany klauzulą poufności, mogę więc powiedzieć jedynie tyle, ile publikujemy w dostępnych publicznie abstraktach z konferencji naukowych. Mogę potwierdzić, że współpracujemy blisko z firmą, która ma licencję na dalszy rozwój kliniczny tego związku.
A co ma pan w planach poza tym?
Dzięki grantowi ETIUDA z Narodowego Centrum Nauki jestem naukowcem wizytującym w Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School w Bostonie. Współpracuję z laboratorium prof. Rubena Carrasco, światowego eksperta w dziedzinie szpiczaka plazmocytowego, jednego z odkrywców jego zależności od interakcji z komórkami śródbłonka. Dzięki zasobom dostępnym na Harvardzie pokonaliśmy szereg problemów technicznych, z którymi bezskutecznie walczyłem w Polsce. Zrealizowałem dzięki temu dużą część mojego doktoratu. Rozpocząłem również współpracę z prof. Carrasco nad innymi projektami związanymi z patogenezą i leczeniem nowotworów, co również na razie objęte jest klauzulą poufności. Rozpoczęliśmy prace w ramach grantu otrzymanego od NIH, dotyczącego rozwoju nowych terapii onkologicznych z użyciem lipidowych nanocząstek wypełnionych antysensownym RNA. Współpracujemy m.in. z prof. Robertem Langerem, współtwórcą szczepionki Moderna mRNA-1273 chroniącej przed COVID-19. Projekt ten jest na razie na etapie przedklinicznym. Mam nadzieję, że po obronie uda mi się również dokończyć tę bardzo ekscytującą i nowatorską koncepcję.
To było pierwsze czy kolejne Pana wystąpienie na konferencji międzynarodowej?
To największe otrzymane dotychczas wyróżnienie i to na konferencji o wysokiej międzynarodowej randze. Wcześniej wygłaszałem jedynie prezentacje na konferencjach studenckich. Bardzo cieszę się, że mogłem zaprezentować niemal finalną wersję naszego projektu. To było niecały tydzień temu, a nasz zespół już nawiązał współpracę z dwoma nowymi polskimi ośrodkami zajmującymi się szpiczakiem plazmocytowym! Pokazałem wyniki naszych badań, ktoś dostrzegł w nich potencjał i postanowił przyłączyć się do projektu. Czy może być większy powód do radości?
Rozmawiała Ewa Biernacka
